死亡时间（postmortem interval， PMI）的推断一直是法医学工作实践和科研攻关的一项重、难点课题。以往的PMI推断研究主要聚焦于个体死后尸体现象和尸体内源性物质变化规律，近年来微生物在尸体腐败过程中的作用成为了一项研究热点。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴。在个体死后，大肠杆菌属于具有较强分解蛋白质能力的腐败菌种，且由于其周身鞭毛能运动，最易出现细菌移位（bacterial translocation， BT）[1-3]。故本实验对SD大鼠心血中大肠杆菌LacZ基因含量的检测方法及其随PMI变化的规律进行了一系列初步研究，探讨利用心血中LacZ基因含量推断PMI的可行性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

EZ1 DNA Investigator Kit（美国 Promega 公司）；Taq DNA 聚合酶（5U/μl，Takara），10×BufferMg2+plus，dNTPs（2.5mM），pMD18-T vector Cloning Kit（宝生物工程（大连）有限公司）引物和Taqman探针（生工生物工程（上海）股份有限公司）；荧光定量PCR仪为ABIPISM-7900HT扩增系统；分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）；EZ1 Advanced XL（美国Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心血DNA样本采集

18只健康SD大鼠，雌雄不限，体重180～200 g。控制室内环境温度25℃，适应性饲养3 d颈椎脱位法处死，按PMI随机分成9组，每组2只，其中1组对照组（死后 0 h），8 组实验组（PMI分别为：12、24、36、48、60、72、84、96 h），置于密闭室内，分别在各时间点取心血100μL，然后应用EZ1 Advanced XL按照EZ1 DNA Investigator Kit说明书进行操作提取心血DNA，最终每组得到DNA洗脱液100μL，-20℃冰冻保存备用。

1.2.2 菌种获取

α（无锡中德美联生物技术有限公司）。

1.2.3 引物及探针

在NCBI上获取已有E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ的序列，选择较保守的一段序列构建探针及引物体系（表1），设计应满足以下几个条件：（1）引物 Tm 值 58～60 ℃；（2）探针 Tm 值 68～70℃；（3）G+C 在 30%～80%之间；（4）引物和探针没有连续3个以上的碱基G；（5）探针5’端第1个碱基不是 G；（6）探针序列中 C 大于 G；（7）扩增片断在50～150 bp之间。

表1 大肠杆菌LacZ基因荧光定量PCR引物和探针序列项目 序列（5’-3’） 序列大小/bp LacZ-YF1 TGGGATCTGCCATTGTCAGA 20 LacZ-YR1 CACTGGTGTGGGCCATAATTC 21 LacZ-YP1 FAM-TATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCG-BHQ 25

1.2.4 标准品质粒的制备

选取E.coli的 β-D-半乳糖苷酶合成基因LacZ上大片段克隆引物（LacZ-DF1和LacZ-DR1）（表2），对模板大肠杆菌D-H-5α进行直接扩增获得PCR产物，经过连接、转化，筛选出所需菌种，并进行测序比对验证，证实重组质粒与设计片段的目标序列完全一致，符合设计要求。

表2 大片段克隆引物的寡核苷酸序列项目 序列（5’-3’） 目标序列长度/bp LacZ-DF1 TGAAGCGACCCGCATTG 570 LacZ-DR1 ATATTCAGCCATGTGCCTTCTT

1.2.5质粒浓度测定

将重组质粒提取物以去离子水稀释，于紫外分光光度计上进行定量，测定其在260nm与280nm的A值，判断其纯度（A260/A280＞1.8为纯品）。 取1μL提取质粒，加入 Nano Drop（Thermo）上，测定三次，然后得出质粒浓度（表3）。

1.2.6 线性标准曲线的建立

以提取的LacZ基因克隆转化菌质粒DNA为模板标准，将其10倍梯度稀释形成浓度为3.747、0.3747、37.47、3.747、0.3747、0.03747 pg/μL，取各稀释梯度模板1μL进行荧光定量PCR扩增，反应体系20μL，均为三个复孔，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线（图1）。

图1 扩增曲线图

以克隆质粒模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线（图2）。曲线回归得标准曲线方程为：Ct=-3.41lgX+25.46（直线斜率 A=-3.41，截距 B=25.46，X 为模板浓度，单位 pg/μL），曲线相关系数r=0.9985，说明标准曲线线性较好。根据A=-1/log（1+E）（E为荧光定量PCR反应的扩增效率），得荧光定量PCR扩增效率为96.34%，符合荧光定量PCR对扩增效率的要求。

图2 标准曲线线性拟合图

1.2.7 qPCR扩增体系及程序

用 2×Mastermix10μL、10μM YF1 1μL、10μM YR1 1μL、10μM Taqman 0.4μL、模板 1μL和ddH2O 6.6μL配置成20μL的扩增体系。

设置扩增程序：（1）50℃，持续 2min；（2）95℃，持续 10min；（3）95℃，持续 15 s；（4）60℃，持续 1min；（5）（2）～（4）步骤 40 个循环。